液氮杜瓦于1892年以其發(fā)明者詹姆斯·杜瓦的名字命名。如今，該設(shè)備最常用的內(nèi)涵是液氮(LN2)罐，在世界上幾乎每個生殖(人類和非人類)實驗室都有幾種設(shè)計之一?，F(xiàn)代液氮罐的設(shè)計源自1956年美國育種者服務(wù)局和美國氰胺公司林德分部合資開發(fā)的第一個實用的胚胎儲罐。在此之前，牲畜飼養(yǎng)者更常使用新鮮或冷卻的胚胎。在胚胎冷凍保存變得可靠后，冷凍保存的胚胎用干冰儲存——研究人員可用的液氮儲存系統(tǒng)不可靠，需要頻繁管理，例如密切監(jiān)測和頻繁填充。

　　現(xiàn)代液氮罐的設(shè)計與林德公司的設(shè)計相比沒有太大變化;內(nèi)罐(容納液態(tài)氣體和冷凍標(biāo)本)懸掛在外殼內(nèi)，周圍有隔熱層和真空空間。鋁是建造小容量儲罐最常用的金屬，鋼用于建造大容量儲罐。

　　儲罐的設(shè)計允許液態(tài)氣體在內(nèi)罐中儲存，同時盡量減少熱量暴露;因此，根據(jù)氣體的不同，氣體可以在接近-200°C或更低的溫度下保持液態(tài)。液氮的工作溫度約為-196°C，而干冰的溫度約為-79°C。液氮罐還保持由溫度接近液態(tài)的氣體蒸氣組成的相對靜態(tài)的頂部空間(非液體)，即使液化氣的體積減少。這種設(shè)計有助于保持氣體和氣體蒸汽體積之間相對穩(wěn)定的內(nèi)部動態(tài)。儲罐未加壓，蒸汽通過儲罐的聚苯乙烯泡沫塑料蓋/塞損失。這導(dǎo)致液氮緩慢但持續(xù)蒸發(fā)。液氮儲罐的日常維護(hù)和填充時間表因?qū)嶒炇叶?，可能涉及每日或每周檢查、監(jiān)測儲罐重量、液化氣液位/體積和/或頂部空間蒸汽溫度。維護(hù)，例如監(jiān)測和填充，可以是手動或自動的。過去，罐體不需要配備緊急呼叫報警系統(tǒng)。最近，提出了正確驗證新儲罐和報警器的指南以及質(zhì)量控制指南。

　　液氮罐的設(shè)計——尺寸、形狀、建筑材料、焊縫和密封劑——并不能絕對防止結(jié)構(gòu)完整性的喪失。金屬疲勞和結(jié)構(gòu)應(yīng)力會導(dǎo)致真空逐漸喪失，液氮的使用逐漸增加。液氮液位的逐漸變化是正常和預(yù)期的，液氮儲罐的制造商宣布，最終所有儲罐都會發(fā)生故障。小容量儲罐最薄弱的區(qū)域之一是將儲罐頸部連接到內(nèi)室和外室頂部的焊縫。油箱的全部重量，通常約為75至100磅，都由這個頸部懸掛。這些頸部焊縫在大容量儲罐中沒有發(fā)現(xiàn)。

　　MVE 47/11液氮罐切開視圖。請注意，整個油箱的重量由粘在內(nèi)外油箱上的頸部支撐

　　由于內(nèi)外容器之間突然出現(xiàn)不可預(yù)測的真空損失，儲罐發(fā)生災(zāi)難性故障，可能導(dǎo)致液氮迅速損失，隨著液氮的蒸發(fā)，儲存內(nèi)容物迅速升溫。保持在臨界玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(約-130°C)以下的試樣可能會暴露在更高的溫度下，對細(xì)胞完整性造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，除非采取措施保護(hù)試樣。

　　人類和動物生殖科學(xué)家討論了液氮罐真空損失的軼事。描述包括儲罐外部濕度增加時，儲罐突然出現(xiàn)冷點、霜凍和水珠。也有報道稱，從儲罐中可以看到蒸汽羽流，在某些情況下，還會聽到儲罐發(fā)出的聲音，當(dāng)然，第二天或幾天后發(fā)現(xiàn)儲罐中幾乎沒有液氮。甚至有報道稱，試樣周圍的內(nèi)罐內(nèi)爆，使其無法移除。

　　直到最近，文獻(xiàn)中還沒有關(guān)于真空損失以及液氮蒸發(fā)速率或儲罐內(nèi)腔溫度變化的詳細(xì)報告或任何研究。真空故障后，儲罐能保持合適的溫度多久，從檢測故障到儲罐達(dá)到臨界溫度有多長時間，甚至真空故障對儲罐特性的影響都是未知的。

　　本研究是為了響應(yīng)開發(fā)可操作數(shù)據(jù)的呼吁而開展的，這些數(shù)據(jù)可以(1)通過監(jiān)測重量和內(nèi)部蒸汽溫度來證明不同設(shè)計(小型臨床到大型商業(yè)儲存)的儲罐中的常規(guī)液氮損失，以及(2)記錄由于外罐外殼的誘導(dǎo)破裂而導(dǎo)致的重量和內(nèi)部蒸氣溫度的變化，從而在每個相同的儲罐中突然失去真空。

　　這項研究將有助于根據(jù)儲罐尺寸——蒸發(fā)率和溫度變化——由儲罐重量和懸掛在儲罐頸部下方的校準(zhǔn)探頭監(jiān)測——來表征災(zāi)難性真空損失后的液氮儲罐行為，并記錄對外部事件的觀察結(jié)果，如霜霜、水珠、蒸汽羽流等。此外，目標(biāo)是提供可操作的數(shù)據(jù)——氣體體積損失率、頂部空間溫度變化率——以使每個單獨的實驗室能夠完善針對此類事件的應(yīng)急響應(yīng)協(xié)議。

　　材料和方法

　　本研究是對低溫儲罐在常規(guī)和真空損失條件下的性能進(jìn)行的多中心調(diào)查。用于這項研究的儲罐是捐贈的，因為使用新的和多個儲罐是禁止的;本研究中捐贈的任何儲罐的使用均不適用納入或排除標(biāo)準(zhǔn)。這些儲罐的特性如表所示。

　　沒有人類受試者參與，也沒有使用或挖掘患者PHI數(shù)據(jù)。材料、監(jiān)測設(shè)備和冷凍儲罐不會直接影響患者護(hù)理;因此，沒有征求內(nèi)部審查委員會的批準(zhǔn)。

　　這項研究的一個公認(rèn)的局限性是，納入了之前可能懷疑或已經(jīng)證明液氮蒸發(fā)增加的儲罐。沒有對每個儲罐進(jìn)行重復(fù)評估，也沒有對低溫儲罐性能進(jìn)行比較統(tǒng)計;數(shù)據(jù)是描述性的，旨在為理解低溫儲罐真空故障的性能特征提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

　　所有參與者使用相同的研究方案來促進(jìn)一致性，同時認(rèn)識到不同的儲罐在誘導(dǎo)真空損失前后可能具有不同的性能特征;無法控制的變量包括罐體的年齡和每個罐體的先前性能歷史。

　　該研究由三個部分組成，旨在確定(1)滿罐、(2)幾乎空罐和(3)真空度因鉆真空口而受損的幾乎空罐的靜態(tài)蒸發(fā)率。這些速率與制造商公布的速率進(jìn)行了比較(如有)。每天或每小時監(jiān)測儲罐的總重量和溫度。為了在英制和公制以及重量和體積之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，使用了磅到克的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換(453.6克/磅)，然后使用液氮的密度(0.807克/毫升)轉(zhuǎn)換為體積。進(jìn)行了額外的實驗，以確定在真空損失后對大容量罐和干燥氮氣托運器做出反應(yīng)所需的時間。

　　測定完整儲罐中液氮(LN2)的靜態(tài)蒸發(fā)速率

　　每個低溫儲罐(大容量查特1840型儲罐除外，見下文)都配備了一個溫度探頭，該探頭連接到Onset Hobo UX100-014M高容量數(shù)據(jù)記錄器。對于小容量罐，探針尖端的放置精確地延伸到塞子內(nèi)表面下方2英寸，對于大容量罐，則延伸到頂部試樣的水平(蓋子底部下方約12厘米)。

　　在填充到邊緣頂部之前，測量了儲罐的空重，這樣當(dāng)插入聚苯乙烯泡沫塑料塞時，多余的液氮就會溢出。對裝滿的儲罐進(jìn)行稱重，該數(shù)據(jù)點變?yōu)閠0。為了確定滿罐中的靜態(tài)日蒸發(fā)率，記錄了總共7天的罐重量。只有一個油箱配備了庫存架(油箱3)。其他的是沒有架子的罐體。

　　為了確定滿罐和幾乎空罐的蒸發(fā)率之間是否存在任何差異，通過將液氮移至6英寸的深度并重復(fù)重量損失測量進(jìn)行了比較。值得注意的是，這些儲罐是由于疑似故障或儲罐老化可能即將發(fā)生故障而捐贈的。

　　在真空受損的小容量系統(tǒng)中測定液氮的靜態(tài)蒸發(fā)速率

　　為了減少油箱從滿到空的時間，對兩個幾乎空的油箱——一個MVE 47/11和一個舊的、停產(chǎn)的聯(lián)合碳化物L(fēng)R-31——進(jìn)行了真空消耗測量。去除液氮，使每個罐中剩余6英寸。與之前的實驗一樣，除了在真空密封接頭(VSJ)上鉆一個1/8英寸的孔或錘擊一個類似大小的釘子穿過VSJ，直到可以聽到空氣進(jìn)入空隙的聲音，絕緣真空屏障受到了損害外，儲存容器的測量方式也是相同的。由于蒸發(fā)速率隨著真空度的降低而急劇增加，因此每小時記錄一次儲罐和液氮內(nèi)容物的重量，直到變空。

　　第三個儲罐，即儲罐3，是一個裝有庫存貨架系統(tǒng)的MVE 47/11儲罐。這是唯一一個在釋放真空后蒸發(fā)速率從滿到空的罐。

　　在真空受損的大容量系統(tǒng)中測定液氮的蒸發(fā)速率

　　在與較小的常規(guī)儲罐類似的過程中，對液氮容量大于600升的大容量系統(tǒng)(查特工業(yè)MVE型號1840)在真空損失后的蒸發(fā)速率進(jìn)行了測試。稱量大容量系統(tǒng)存在幾個后勤障礙，包括是否有足夠容量的磅秤來測量600升系統(tǒng)的總重量，以及能否將其移入和移出磅秤。除了使用刻度尺手動進(jìn)行液氮液位監(jiān)測外，實驗設(shè)計與較小儲罐的設(shè)計相似。維薩拉HMT140高容量數(shù)據(jù)記錄器用于記錄溫度。通過將溫度探頭放置在正常監(jiān)測位置，剛好高于之前驗證的最低液位，以產(chǎn)生-185°C的溫度，即系統(tǒng)報警閾值，來獲得溫度測量值。儲罐中的氮氣液位設(shè)置在會引起報警的液位附近。一旦溫度警報響起，測量就開始了。

　　真空密閉干式托運箱中液氮蒸發(fā)速率的測定

　　按照制造商建議的方法，將一個小型干式托運人(MVE SC4/3E)裝滿液氮。在測試前兩小時，每15分鐘向托運人加滿液氮，以確保其處于完全充電狀態(tài)。然后，它安裝了兩個溫度探頭，一個距離塞子2英寸，另一個距離底部6英寸。每小時測量一次油箱的重量，直到它與空油箱的重量相同。接下來，按照上述方法重新填充油箱，并用1/8英寸鉆頭鉆VSJ來釋放真空。每分鐘記錄一次溫度，每小時記錄一次重量，直到油箱達(dá)到室溫。

　　結(jié)果

　　在真空受損的小容量系統(tǒng)中測定液氮的靜態(tài)蒸發(fā)速率

　　小型儲罐最顯著的結(jié)果是，在鉆孔以去除真空后的前6小時內(nèi)，蒸發(fā)率從每天不到1升上升到每天至少40升(表1)。隨著儲罐液氮的耗盡，這一速率緩慢下降。較小的聯(lián)合碳化物罐在真空損失后持續(xù)不到1天。罐2持續(xù)約18小時以完成蒸發(fā)，罐3也是如此(約18小時完成蒸發(fā))，盡管罐3中的初始蒸發(fā)速率高于罐2。儲罐2和儲罐3之間的區(qū)別在于儲罐3配備了庫存貨架系統(tǒng)。隨著儲罐中液氮的耗盡，平均蒸發(fā)速率(升/小時)略有變化。蒸發(fā)速率開始很高，然后在儲罐中的液氮耗盡時降至零。在真空喪失3小時內(nèi)，觀察到蓋子附近結(jié)霜和水珠。

　　小容量儲罐的液氮蒸發(fā)速率。制造商聲明的蒸發(fā)率為0.39L/天。真空失效3小時后，儲罐的蒸發(fā)率為70L/天，失效6小時后達(dá)到最大蒸發(fā)率90L/天

　　罐體故障的最初跡象之一是罐體外部結(jié)霜和水珠。這張照片是小容量MVE 47/11和大容量MVE 1840

　　溫度探頭放置在頂部附近(2英寸以內(nèi))，靠近大多數(shù)儲罐中試樣的位置。在最小容量的儲罐(LR-31;30 L)中，鉆井后約8小時，下部探頭的臨界溫度達(dá)到-130°C。在稍大的MVE 47/11中，儲罐2在近27.6小時后達(dá)到臨界溫度，儲罐3(帶機(jī)架)在20小時后達(dá)到，而未鉆井但失效的儲罐4則需要35小時以上。

　　與氮消耗有關(guān)，在所有液氮蒸發(fā)后不久，臨界溫度很快達(dá)到。在罐2中，在排空后2小時內(nèi)達(dá)到臨界溫度。在受損但完好無損的儲罐4中，這發(fā)生在1小時內(nèi)。

　　上探頭(藍(lán)線)和下探頭(紅線)的液氮體積(綠線)和溫度圖

　　為了了解這些儲罐是如何制造的，我們切開其中一個儲罐(儲罐3)，檢查頸部與內(nèi)外儲罐的連接(見圖1)。

　　在真空受損的大容量系統(tǒng)中測定液氮的靜態(tài)蒸發(fā)速率

　　在近700升的大型儲罐中，從報警到試樣達(dá)到-130°C的臨界溫度的時間約為15小時。從報警到液氮耗盡總共花費了近31小時。有趣的是，鉆后蒸發(fā)率為31.4 L/天，僅為制造商列出的鉆前蒸發(fā)率12.5 L/天的3倍左右。還觀察到儲罐蓋上結(jié)霜。

　　鉆探以釋放真空的大容量MVE 1840的液氮使用量(藍(lán)線)和溫度(紅線)

　　真空密閉干式托運器中液氮的靜態(tài)蒸發(fā)速率

　　干式托運人的數(shù)據(jù)。在沒有真空的情況下，罐的蒸發(fā)速率從0.15升/天增加到超過11升/天。靜態(tài)保持時間從22.5天縮短到不到1天。故障發(fā)生約6小時后，儲罐溫度高于臨界溫度。

　　干燥托運箱的溫度(藍(lán)線)和液氮使用量(橙線)，通過鉆真空口釋放真空

　　討論

　　最近，液氮儲罐發(fā)生了兩起廣為人知的故障，促使那些儲存人體組織的人重新審視這些組織在表面上是為儲存公牛胚胎而設(shè)計的儲罐中的安全性。鑒于這些失敗，考慮設(shè)施在進(jìn)行低溫儲存時面臨的責(zé)任程度也是明智的[7]。迄今為止，幾乎沒有關(guān)于氮氣儲罐故障原因或故障時性能變化的報道。在這項研究中，通過在真空端口鉆孔并允許真空逸出，捐贈儲罐的真空隔熱性能被破壞。在三種類型的罐中測量了真空去除前后液氮的蒸發(fā)率：小容量儲存、大容量儲存和干式托運。

　　這項研究存在公認(rèn)的局限性，包括捐贈的儲罐因年齡而異，其中包括一些預(yù)先存在較高液氮蒸發(fā)率的儲罐，這些儲罐被歸類為故障儲罐。作者還認(rèn)識到，本研究可能無法證明或反駁軼事觀察或猜測;但事實證明，這些軼事中有許多是真的;液氮的快速和不可預(yù)測的損失、儲罐的個體性能特征以及外部故障指標(biāo)，例如霜凍、水珠、空氣通過損壞部位的聲音運動等。

　　無論如何，這項研究提供的數(shù)據(jù)是獨一無二的，應(yīng)該保守地看待，在情況允許的情況下，作為個別診所進(jìn)一步探索的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

　　除大容量托運人外，所有儲罐的初始制造商蒸發(fā)率均低于每天1升。當(dāng)將實際蒸發(fā)率與制造商的蒸發(fā)率進(jìn)行比較時，所有儲罐的蒸發(fā)率都略高。這很可能是因為這些儲罐要么已經(jīng)使用了多年，要么由于液氮蒸發(fā)率隨時間的推移而逐漸增加，預(yù)計儲罐會發(fā)生故障。在通過鉆出真空端口釋放真空后，液氮蒸發(fā)速率在小型和大型儲罐中急劇增加到每天30至40升，在相當(dāng)小的氮氣運輸船中增加到超過12升。這種蒸發(fā)速率意味著，在真空損失發(fā)生后，小型液氮罐將容納氮氣24小時多一點，而在干燥的托運人中則不到6小時。

　　值得注意的是，兩個非常相似的儲罐(儲罐2和儲罐3)在故障后的蒸發(fā)率存在差異。儲罐3的平均蒸發(fā)速率要高得多(見表)。這兩個罐體都是MVE 47/11型，但請注意，罐體3配備了完整的存儲架系統(tǒng)：罐子、手杖和高腳杯，以模擬完整的庫存。該儲罐(空)的基重為33.6磅和44.8磅(帶機(jī)架系統(tǒng))，液氮填充后為122.8磅;該罐在誘導(dǎo)真空故障之前被描述為功能齊全，并于1990年制造(5)。機(jī)架系統(tǒng)的額外質(zhì)量以及隨之而來的液氮的位移有效地減少了儲罐3中的液氮量，并可能影響了儲罐3的初始和平均蒸發(fā)速率。這是一個關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)和推測，需要更多的測試，盡管儲罐3中液氮完全耗盡的時間與儲罐2相似。

　　我們還觀察到，只要罐中有一些液氮，組織附近的溫度就會保持在約-130°C的臨界玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以下。一旦液氮消失，溫度將在大約90分鐘內(nèi)迅速升至室溫)。甚至在真空破裂后，儲罐頂部附近的溫度變化也非常緩慢。這對于如何設(shè)置觸發(fā)警報的探測器具有至關(guān)重要的意義。至少有一家制造商銷售用于低溫罐的溫度報警探頭，該探頭被編程為在探頭達(dá)到-150°C的溫度時報警。我們的研究表明，對于這種報警器的大多數(shù)應(yīng)用，它放置在聚苯乙烯泡沫塑料塞下方約2英寸處，在試樣有失透危險之前，報警器只會在大約1.1小時內(nèi)發(fā)出聲音。對于許多診所來說，這可能沒有足夠的時間開車去實驗室搶救標(biāo)本。

　　盡管本研究中未對液位報警或其他機(jī)制進(jìn)行評估，例如監(jiān)測儲罐的重量，可能比溫度報警更有效，但應(yīng)徹底測試任何報警系統(tǒng)是否發(fā)生故障，以確保它為發(fā)生故障的儲罐提供足夠的響應(yīng)時間。我們的研究表明，如果可以通過氮氣液位報警器或可以測量儲罐重量的設(shè)備檢測到氮氣蒸發(fā)的早期增加，那么響應(yīng)時間大約為18小時——只要有一個裝有液氮的備用儲罐可用，就足以處理大多數(shù)緊急情況。應(yīng)使用至少一個位于實際試樣深度附近的溫度探頭，以便能夠證明試樣沒有暴露在允許失透的次優(yōu)溫度下。

　　同樣重要的是要注意，由于干燥托運人儲存的液氮體積較小(約3.4升)，他們的等待時間相對較短。這些容器中的真空損失可能會導(dǎo)致整個水箱在5或6小時內(nèi)變干。其中一位作者(KP)觀察到一個事件，一個全新的干燥托運人將組織運送到幾百英里外的另一家診所。罐體到達(dá)時，天氣溫暖干燥。水箱失靈了，珍貴的組織無法存活。當(dāng)測試這個新罐時，發(fā)現(xiàn)它的氮氣蒸發(fā)率過高，很可能是由于制造不善。

　　總之，當(dāng)一個滿的小容量水箱發(fā)生泄漏時，人們有大約18小時的時間來檢測故障并搶救組織。這假設(shè)正在對儲罐進(jìn)行監(jiān)測，以便它們可以檢測到前3小時內(nèi)發(fā)生的蒸發(fā)率增加。位于儲罐頂部附近的溫度探頭似乎不足以快速檢測出發(fā)生故障的儲罐。人們需要一個系統(tǒng)來檢測蒸發(fā)速率的這種快速變化或氮消耗的這種快速增加[8]。無論如何，整個系統(tǒng)——儲罐、探頭和報警器——都應(yīng)該進(jìn)行故障測試，以確定并確保足夠的響應(yīng)時間。小容量油箱非常有效。只要罐中還有液氮，它們就可以將溫度保持在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的臨界溫度以下。希望這項研究將提供急需的數(shù)據(jù)，以幫助制造商生產(chǎn)更安全的儲罐，并改進(jìn)工作實驗室協(xié)議，從而避免類似的胚胎和卵子丟失事件。